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微生物的实验室培养

更新时间:2016-8-23 13:21:00  手机版

  微生物的实验室培养:

  1.培养基的概念、种类及营养构成

  (1)概念:人们按照微生物对营养物质的不同需求,配制出的供其生长繁殖的营养基质。

    

  (3)营养构成:各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐,此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。

  2.无菌技术

  (1)关键:防止外来杂菌的入侵。

  (2)具体操作

  ①对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。

  ②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。

  ③为避免周围环境中微生物的污染,实验操作应在酒精灯火焰附近进行。

  ④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。

  (3)消毒和灭菌

  3、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的方法:计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。

  4、接种方法:平板划线法和稀释涂布法。

  (1)平板划线操作:

  ①挑取他含菌样品:选用平整、圆滑的接种环,按无菌操作法挑取少量菌种。

  ②划A区:将平板倒置于煤气(酒精)灯旁,左手拿出皿底并尽量使平板垂直于桌面,有培养基一面向着煤气灯(这时皿盖朝上,仍留在煤气灯旁),右手拿接种环先在A区划3—4条连续的平行线(线条多少应依挑菌量的多少面定)。划完A区后应立即烧掉环上的残菌,以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。在烧接种环时,左手持皿底并将其覆盖在皿盖上方(不要放入皿盖内),以防止杂菌的污染。

  ③划其他区:将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下,并使B区转到上方,接种环通过A区(菌源区)将菌带到B区,随即划数条致密的平行线。再从B区作C区的划线。最后经C区作D区的划线,D区的线条应与A区平行,但划D区时切勿重新接触A、B区,以免极该两区中浓密的菌液带到D区,影响单菌落的形成。随即将皿底放入皿盖中。烧去接种环上的残菌。

  ④等平板凝固后,将平板倒置。

  (2)稀释涂布法:是将菌液进行一系列的梯度稀释,然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面,在适宜条件下培养。在稀释度足够高的菌液里,聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞,从而能在培养基表面形成单个的菌落。能够测定样品中活菌数的方法是:稀释涂布平板法。

  纯化大肠杆菌的无菌操作和菌种保存:

  1.大肠杆菌

  (1)特性:革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌。

  (2)用途:是基因工程技术中被广泛采用的工具。

  2.制备牛肉膏蛋白胨固体培养基

  (1)计算:依据是培养基配方的比例。

  (2)称量:牛肉膏比较黏稠,可同称量纸一块称取。牛肉膏和蛋白胨易吸潮,称取时动作要迅速,称后及时盖上瓶盖。

  (3)溶化:牛肉膏和称量纸+水加热取出称量纸→加蛋白胨和氯化钠→加琼脂(注意:要不断用玻璃棒搅拌,防止琼脂糊底而导致烧杯破裂)→补加蒸馏水至100mL。

    

  3.纯化大肠杆菌

  (1)方法

  ①平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。

  ②稀释涂布平板法:将骏业进行一系列的梯度稀释,然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面,进行培养。

  (2)鉴定:将接种后的培养基和一个未接种的培养基(对照组)都放入到37℃恒温箱中,培养12h和24h后,分别观察并记录结果。

  (3)菌种保存

  知识点拨:

  1、无菌技术操作原则:

  (1)操作前准备:

  ①操作环境应清洁、宽敞、定期消毒;物品布局合理;无菌操作前半小时应停止清扫工作、减少走动、避免尘土飞扬。

  ②工作人员应做好个人准备,戴好帽子、口罩,修剪指甲并洗手,必要时穿无菌衣、带无菌手套。

  (2)操作中保持无菌

  ①工作人员应面向无菌区,手臂应保持在腰部或操作台台面以上,不可跨越无菌区避免面对无菌区谈笑、咳嗽、打喷嚏。

  ②用无菌持物镊取用物品;无菌物品一经取出,即使未用,也不可放回无菌容器内;一套无菌物品仅供一位患者使用,避免交叉感染。 ③无菌操作中,无菌物品疑有污染或已被污染,应予更换并重新灭菌。

  (3)无菌物品保管:

  ①无菌物品必须与非无菌物品分开放置。

  ②无菌物品不可暴露于空气中,应存放于无菌包或无菌容器中,无菌包外须标明物品名称、灭菌日期,并按失效期先后顺序排放。

  ③定期检查无菌物品的灭菌日期及保存情况。无菌包在未被污染的情况下保存期一般为7天,过期或受潮应重新灭菌。

  2、划线分离操作中的有关问题:

  (1)在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环,在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环。

  ②在灼烧接种环之后,要等其冷却后再进行划线,以免接种环温度太高,杀死菌种。

  ③在进行第二次以及其后的划线操作时'要从上一次划线的末端开始划线。每次划线后,线条末端细菌的数目比线条起始处要少,每次从上一次划线的末端开始,能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少,最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。

  (2)进行恒温培养时,要将培养皿倒置的原因如果正放培养皿,则皿盖上形成的水滴会落入培 养基表面并且扩散开。如果培养皿中已形成菌落,则茵落中的细菌会随水扩散,菌落间相互影响,很难再分成单菌落,达不到分离的目的。因此恒温培养时,培养皿必须倒置。

  (3)培养后判断是否有杂菌污染的方法

  ①从菌落的形态看,是否湿润、透明、黏稠,呈何种颜色等等,是区别细菌、酵母菌、放线菌和霉菌的关键指标。

  ②用显微镜镜检观察其形态、大小,看是否有菌丝、孢子、芽孢等,这也是区别细菌、酵母菌、放线菌和霉菌的关键指标。

  知识拓展:

  1、对异养微生物来说,含C、N的化合物既是碳源,也是氮源,即有些化合物作为营养要素成分时并不是起单一方面的作用。

  2、并不是所有微生物都需添加特殊营养物质,有些微生物需添加,原因是它们自身缺乏合成这些物质所需要的酶或合成能力有限。

  3、含抗生素的牛奶不能发酵为酸奶的原因:牛奶发酵成酸奶是利用乳酸菌来完成的,乳酸菌属于细菌,

  4、化学药剂的消毒方法,其作用原理是使细菌体内蛋白质变性,但是化学物质很难透过孢子或芽孢的坚硬外层进入细胞内,因此化学方法难以消灭孢子和芽孢。

  5、体积分数为70%的乙醇杀菌效果最强,浓度过低,杀菌力弱,浓度过高,使菌体表面蛋白质凝固形,成一层保护膜,乙醇分子不能渗入其内,因此杀菌效果受影响。

  6、倒平板的方法:右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边,用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出,试管或瓶口保持对着火焰;然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住管(瓶)塞(也可将试管塞或瓶塞放在左手边缘或小指与无名指之间夹住。如果试管内或三角瓶内的培养基一次用完,管塞或瓶塞则不必夹在手中)。左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝,迅速例入培养基约15mL,加盖后轻轻摇动培养皿,使培养基均匀分布在培养皿底部,然后平置于桌面上,待凝后即为平板。

  7、在斜面培养基上接种时,其正确的操作顺序:

  ①用左手大拇指、食指和无名指夹住菌种试管和待接种的斜面试管,管口并齐,使斜面向上成水平状态

  ②右手拧松棉塞,但不取下

  ③右手拿接种环,在火焰上灼烧灭菌

  ④在火焰边用右手无名指和小指夹两个棉塞,将它们取下,同时左腕转动,灼烧管口一周

  ⑤将接种环伸入管内,让环先接触培养基上未长菌的部位,使环冷却,然后轻轻挑取少量菌体

  ⑥在火焰旁边迅速将沾有菌体的接种环伸到培养基的底部,由里向外轻轻画蛇形细线

  ⑦抽出接种环,再用火焰灼烧管口,并在火焰上方将棉塞塞上

  8、自养型微生物与异养型微生物的培养基的主要差别在于碳源。

  9、平菇培养的操作程序:配制棉籽壳培养基,高压蒸汽灭菌,接种,培养。

  10、菌种的保存:对于频繁使用的菌种,可以采用临时保藏的方法;临时保藏的菌种一般是接种到试管的固体斜面培养基上;临时保藏的菌种容易被污染或产生变异;在临时保藏过程中,每3~6个月都要重新将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上。

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